nhờ thế mà từ đầu thế kỷ 21, chi phí giải trình tự ADN đã nhanh chóng giảm - từ một tỷ đôla xuống chỉ còn một nghìn đôla
Khởi đầu
năm 1997 cộng tác viên John Stuelpnagel làm cho quỹ đầu tư CW Group ở thành phố New York đã nhận được một lá thư từ một người quen ở văn phòng đăng ký bản quyền công nghệ
SNP [đa hình nucleotide đơn]
sản phẩm đầu tiên của illumina tập trung vào một loại đo lường biển thể gen, gọi tên là đa hình nu-clê-ô-tít đơn [single nucleotide polymorphism]
Những hạt
cái mà David Walt trình bày cho Stuelpnagel và các nhà đầu tư ở CW Group thì không phải là sản phẩm, mà đơn thuần là một công nghệ
Walt giải thích rằng ta có thể khắc [etch] những lỗ giếng vào phần cuối của một gói sợi quang, sau đó đặt một hạt nhỏ chỉ 3-5 micromet vào mỗi lỗ giếng được khắc
những hạt nhỏ này có thể biến ra một màu huỳnh quang nhìn thấy được khi ở gần một chất thơm [mùi thơm]
ánh sáng ấy sẽ đi qua sợi quang để được nhận biết bởi một hệ thống camera CCD [linh kiện tích điện kép charge coupled device]
Walt mường tượng rằng công nghệ sợi quang này có thể tạo ra những cảm biến ADN
các đồng sáng lập của illumina đã đối mặt với thử thách biến thí nghiệm khoa học này thành một sản phẩm thực tế
Những hạt trở thành mảng hạt
năm 2002 illumina ra mắt sản phẩm đầu tiên: mảng hạt - bấy giờ được mở rộng thành một nền tảng hoàn chỉnh
các tế bào ADN của mẫu sẽ gắn kết vào những hạt phù hợp
tuỳ theo hệ thống, hoặc là mẫu hoặc là những hạt sẽ bị đính vào một màu nhuộm huỳnh quang [fluorescent dye]
SNP là thành công thương mại đầu tiên của illumina nhưng công ty biết là phương pháp đo lường này sẽ đối mặt một đe doạ dài hạn từ thị trường liền kề: giải trình tự ADN
Kiểu gen và giải trình tự ADN
một máy giải trình tự gen sẽ sản xuất [đọc] ra trình tự ADN bao gồm những chuỗi chữ cái A, T, C và G với chữ cái thứ năm là N dành cho chưa xác định
phương pháp xác định kiểu gen SNP thì giống như đọc một vài từ hoặc trích dẫn trong một cuốn sách; giải trình tự ADN thì là đọc những đoạn trích lớn hơn của cuốn sách ấy, thậm chí là đọc cả quyển sách
Ngành giải trình tự ADN
năm 1953 Watson và Crick, dựa vào công trình của Franklin và Wilkins, đã khám phá ra cấu trúc xoắn kép của ADN
ADN thì khó giải trình tự hơn là protein đơn thuần, vì tế bào ADN dài hơn, ít đơn vị cấu thành hơn: 4 base ADN, khác với những amino axit ở protein thì base ADN khó phân biệt hơn
ARN sang ADN
những nỗ lực ban đầu đã tập trung vào giải trình tự ARN
một số loại tế bào ARN thì tương tự protein hơn và các nhà khoa học đã nhận ra rằng có thể áp dụng những phương pháp giải trình tự protein, nhờ thế
năm 1965 Robert Holley (ảnh dưới ngoài cùng bên trái) lần đầu tiên hoàn toàn giải trình tự được một loại ARN vận chuyển [tRNA / transfer RNA] trong một loài nấm men [yeast]
Dư và khuyết [plus and minus]
năm 1975 Sanger và đồng sự Alan R.Coulson (ảnh dưới) đã giới thiệu phương pháp "dư và khuyết" để giải trình tự ADN
phương pháp ban đầu của Sanger sẽ liên quan đến việc chuẩn bị 4 hỗn hợp, mỗi hỗn hợp bao gồm:
1 là thiết kế mẫu [template] ADN ta muốn giải trình tự
2 là enzym ADN polymerase để xúc tác việc tổng hợp các tế bào ADN từ những đơn phân [molecular precursor] đã có
3 là một kem lót [primer] cần thiết để kích tiến trình tổng hợp ADN
4 là những tế bào đơn phân [molecular precusor] ADN sẵn có là những deoxynucleotide: adenine [A], thymine [T], cytosine [C] và guanine [G] - mỗi deoxynucleotide ấy sẽ được đính với một hoá chất phóng xạ
hiện diện của enzym polymerase và kem lót, cùng với 4 hỗn hợp sẽ kích hoạt việc tổng hợp ADN mới
những chủng ADN mới sẽ đa dạng về chiều dài
sau đó ta chia tách 4 hỗn hợp này ra 8 bình chứa, sau đó thực hiện một lượt thứ hai những phản ứng emzym polymerase trên mỗi nửa của 8 biến thể
tuy nhiên, một bí quyết là ta loại bỏ phản ứng ở một bước nhất định trong chuỗi bằng cách giữ lại một nguyên liệu quan trọng: một hoặc vài trong số 4 cơ sở [base] nucleotide
phản ứng hoàn chỉnh cũ sẽ cần cả 4 cơ sở hiện diện - đây là lý do những phản ứng không hoàn chỉnh mới được gọi là "dư" [plus] và "khuyết" [minus]
với phản ứng 'khuyết' ta cho vào 3 trong số 4 cơ sở, nghĩa là giữ lại 1 - tạo ra những đoạn ADN kéo dài mà tất cả bị loại bỏ [terminate] ngay trước cơ sở [base] bị thiếu [missing]
với phản ứng 'dư' ta cho vào chỉ 1 cơ sở, nghĩa là giữ lại 3 - khiến tất cả đoạn ADN kéo dài được tạo ra sẽ chấm dứt với một cơ sở đó
với cách này, ta có thể đổ những thứ đựng trong 8 bình chứa vào những vạt gel polyacrylamide [hoá chất PAM] và sử dụng phương pháp điện di trên gel để tách và phân loại những đoạn ADN kéo dài, chia ra dựa theo kích cỡ
sao đó ta đặt 8 vạt lên một cuộn phim X-Ray và để qua đêm
sau khi ta gây dựng được phim, ta có thể tìm ra vị trí của các nucleotide trong những mảnh ADN, lên đến 50 cơ sở
Thế hệ đầu
2 nhà khoa học khác là Allan Maxam và Walter Gilbert đã ra mắt phương pháp riêng: cũng sử dụng những gel polyacrylamide [hoá chất PAM] để phân loại những mảnh ADN đã đính phóng xạ, phân loại theo chiều dài - nhưng sử dụng phương pháp khác để sản xuất những mảnh ấy
phương pháp giải mã gen Maxam-Gilbert mới đầu phổ biến vì không cần nhiều bước chuẩn bị như "dư và khuyết" nhưng lại cần sử dụng những chất hoá học độc hại nhất định
năm 1977 Sanger ra mắt phương pháp gián-đoạn-chuỗi dideoxy [PCR] thay đổi một số nguyên liệu: trong đó có nucleotide đính phóng xạ được sử dụng, làm thế để đọc được những chuỗi dài hơn
phương pháp gián-đoạn-chuỗi dideoxy sau này được đổi tên là phương pháp giải trình tự Sanger và trở thành bản lề của cái ta gọi là thế hệ đầu tiên của giải trình tự gen tự động
bước ngoặt năm 1977 này đã giúp Sanger lần thứ hai đoạt giải Nober hoá học, chia sẻ giải thưởng với Walter Gilbert và Paul Berg
năm 1986 công ty Applied Biosystems đã ra mắt một "máy giải trình tự ADN tự động" là chiếc ABI 370A
ban đầu, máy giống như một hệ thống giúp đọc và dịch nghĩa dữ liệu, nhưng tự động hoá đã tiến bộ nhanh chóng
thập niên 1990 Applied Biosystems là tiên phong thị trường trong công nghệ giải trình tự ADN
học viện y tế quốc gia đã sử dụng ABI 370A cho dự án kiểu gen người
Thế hệ hai
những máy giải trình tự ADN sẽ cạnh tranh nhau trên thương trường dựa vào độ chuẩn xác của cái đọc ra, tốc độ đọc và công suất đọc mỗi lần chạy - và cả giá bán nữa
thế hệ máy giải trình tự ADN đầu tiên dựa vào phương pháp Sanger, phần lớn bị nhược điểm ở xuất lượng và chi phí
thập niên 2000 những công nghệ mới đã trỗi dậy để tăng xuất lượng với việc "song song hoá" - khuếch đại mẫu ADN, tách ra nhiều mảnh nhỏ và đọc những mảnh ấy cùng một lúc
một chương trình máy tính có tên là phần mềm gióng thẳng hàng các chuỗi [sequence alignment] sau đó có thể tập hợp những mảnh đã tách chuỗi lại - đã có những phần mềm, cả mã nguồn mở và thương mại, thực hiện việc này với nhiều mức độ tinh vi/chuẩn xác
khả năng đột phá là thực hiện đọc một triệu hoặc tỷ chuỗi trong mỗi lần chạy, sử dụng "song song hoá" và vì thế có cái tên "thế hệ giải trình tự tiếp theo" hay "giải trình tự xuất lượng cao"
công ty lớn đầu tiên đã thương mại hoá công nghệ này là 454 Life Sciences sử dụng một phương pháp mới phát hiện là "pyrosequencing"
pyrosequencing tận dụng lợi thế của một phản ứng 2 enzym tạo ra ánh sáng huỳnh quang là hiệu ứng phụ
ta có thể kích hoạt phản ứng này trong tổng hợp ADN để đo lường xem cặp cơ sở này đang được thêm vào trong quá trình tổng hợp
454 sau này đã được Roche Diagnostics mua lại: máy giải trình tự đầu tiên của công ty là chiếc GS20 ra mắt năm 2003 và có thể đọc tổng cộng 25 triệu cặp cơ sở trong một lần chạy 4 giờ với chi phí chỉ bằng 1 phần 6 công nghệ tự động Sanger cũ
Solexa
Solexa được thành lập bởi 2 nhà hoá học Anh từ trường Cambridge là Shankar Balasubramanian gốc Ấn và David Klenerman
phương pháp của Solexa để giải trình tự gen - có tên là giải trình tự bằng tổng hợp - rất phức tạp: sau đây là nói cực kỳ đơn giản hoá
ta thêm những chất hoá học chuyển đổi [adapter chemical] vào cuối của những mảnh nhỏ này để mục đích đánh dấu
sau đó ta cắm cả vào một đĩa thể rắn
sau đó sử dụng phương pháp khuếch đại cầu nối PCR để tạo ra một triệu phiên bản của mỗi mảnh nhỏ, được gọi là những cụm
giống với pyrosequencing thì ta kích hoạt một phản ứng tổng hợp ADN sử dụng enzym polymerase và sử dụng huỳnh quang để theo dõi
trong phản ứng tổng hợp, những cụm ADN trên đĩa sẽ nhặt lấy những nucleotide bổ sung [complementary] để hợp với chuỗi đã có: C cặp với G, A cặp với T và ngược lại
giống như giải trình tự Sanger thì ta chặn và cắt giảm phản ứng tổng hợp ADN hoàn chỉnh để nó chỉ nhặt lấy một nucleotide mỗi lần
ta đính mỗi nucleotide này với một huỳnh quang sẽ rực sáng khi phơi dưới đèn laser
một camera CCD sẽ đọc tín hiệu ánh sáng và biết được chuỗi nucleotide của cụm
cải tiến của Solexa là sử dụng khuếch đại ADN lên một bề mặt rắn để củng cố tín hiệu ánh sáng huỳnh quang - không chỉ giúp chính xác cao độ mà còn có nghĩa là Solexa không cần những thấu kính [linh kiện quang học] đắt đỏ và nhạy bén
Máy của Solexa
năm 2005 Solexa lên sàn chứng khoán NASDAQ nhờ thương vụ sát nhập với công ty công nghệ sinh học Lynx ở vịnh San Francisco thành một công ty hợp nhất có giá trị vốn hoá 200 triệu đôla Mỹ
những thiết bị sau này đã vượt lên con số ấy: 20, 30 và lên đến 50 gigabase mỗi lần chạy liên tục suốt nhiều ngày
năm 2012 công nghệ của Solexa sẽ trang bị chiếc HiSeq2500 có thể giải trình tự 600 gigabase với 99.9% độ chuẩn xác
lý do có lẽ là để dự phòng [redundancy] để tránh những lỗi dương tính giả [false positive] hoặc âm tính giả trong quá trình giải trình tự
mỗi thiết bị bán giá 400 000 đôla, chiếc máy Genetic Analyzer đắt hơn những máy bấy giờ nhưng chi phí trung bình mỗi gigabase thì hợp lý
Mua bán sát nhập
tháng 11 năm 2006 sau khi máy Genome Analyzer ra mắt, illumina đề nghị 650 triệu đôla mua Solexa
thêm nữa, illumina muốn bổ sung vào những nền tảng đã có của công ty những công nghệ 'song song hoá' cho phép Solexa giải trình tự toàn bộ kiểu gen với quy mô lớn
thương vụ sát nhập thành công vang dội, ngành nhanh chóng sử dụng công nghệ của Solexa, bấy giờ đã là của illumina, để tiếp cận việc giải trình tự ADN
những hợp tác mới với công nghiệp và hàn lâm cũng đã tạo ra những cơ hội mới
giới nghiên cứu càng sử dụng sản phẩm của illumina để sản xuất ra những bài viết nhiều-trích-dẫn và được bình duyệt thì công ty càng được củng cố vị thế là tiên phong vững chắc cho thế hệ hai của giải trình tự ADN
ngày nay illumina chiếm 80% thị phần giải trình tự ADN và tạo được 90% dữ liệu chuỗi ADN
Kiện tụng
ngành công nghệ sinh học thì phụ thuộc nhiều vào bản quyền sở hữu trí tuệ, nhận bằng sáng chế và được bảo vệ bằng sáng chế
năm 2004 Affymetrix nộp đơn khởi kiện sản phẩm BeadChip [chip hạt] và Array Matrix [ma trận mảng] của illumina đã vi phạm 6 bằng sáng chế của công ty [Affymetrix] - illumina đã đâm đơn phản tố
năm 2008 hai công ty đã dàn xếp giải quyết vụ kiện: illumina chi trả 90 triệu đôla nhưng không thừa nhận tội
sau khi ra mắt máy giải trình tự thế hệ hai đã-được-tăng-cường-song-song-hoá thì illumina bị ABI - công ty tiên phong thế hệ đầu - và trường đại học Columbia kiện
một công ty khởi nghiệp công nghệ sinh học khác là Helicos cũng kiện illumina
sau nhiều năm, những bằng sáng chế của Helicos đã bị một thẩm phán bỏ qua
năm 2010 và 2012 illumina khởi kiện công ty Complete Genomics mới nổi với 90 khách hàng và ghi nhận doanh thu đâu đó 30 triệu đôla
không phải vụ kiện nào cũng thắng, năm 2022 lộ tin một vụ xử đã trao cho BGI được bồi thường 300 triệu đôla thiệt hại do bản quyền sáng chế từ thương vụ sát nhập Complete Genomics
Thêm mua bán sát nhập
illumina cũng nhạy bén tìm mua công ty - rốt cuộc thì thương vụ sát nhập Solexa đã củng cố vị thế thống trị của illumina trong thị trường giải trình tự kiểu gen thế hệ 2
có 2 nỗ lực thôn tính của illumina đã vi phạm luật chống độc quyền
tháng 11 năm 2018 illumina đề nghị 1.2 tỷ đôla mua lại Pacific Biosciences
Pacific Biosciences có một công nghệ có khả năng đọc những chuỗi dài hơn: dài 15000 cơ sở, so với 50-300 cơ sở của illumina
công ty hợp nhất giữa Pacific Biosciences [PacBio] và illumina sẽ chỉ có ít đối thủ: một đối thủ nặng ký là Nanopore với sản phẩm Minion
rồi tuyên bố thương vụ sát nhập GRAIL - một cựu spin-off [thương mại hoá quyền sở hữu trí tuệ] của illumina - xét nghiệm nhiều bệnh ung thư giai đoạn đầu trong máu bằng cách sử dụng giải trình tự ADN
thương vụ đã đánh động các nhà làm chính sách, cho rằng nó là một thương vụ mở rộng theo chiều dọc bất hợp pháp - illumina là nhà cung cấp độc quyền thiết bị giải trình tự ADN và nếu mua lại GRAIL thì sẽ tạo động cơ cho illumina cắt bỏ những đối thủ cạnh tranh của GRAIL khỏi một phần thiết bị cần thiết
illumina vẫn chốt thương vụ - một động thái "chơi ngông" - hiện nay tại thời điểm bài viết này thì ta vẫn đang chờ động thái của châu Âu
Kết
một số bằng sáng chế 'lõi' của illumina trong giải trình tự thế hệ 2 đang bắt đầu hết hạn, cho nên những phiên bản tương tự với phần cứng ban đầu của công ty, cũng như những chất hoá học để vận hành việc giải trình tự - gọi là những vật tư tiêu hao - đã được cho phép
tiêu chuẩn phần mềm và dữ liệu của illumina đã trở thành một nền móng công nghiệp, như của Adobe
illumina tiếp tục thương chiến với các đối thủ, hạ giá bán và tăng xuất lượng, thì có lẽ lợi ích lớn nhất cho khách hàng sẽ là những thấu hiểu mà ta có thể lượm lặt từ những bộ dữ liệu giá rẻ của một bộ gen hoàn chỉnh
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét